Immünfloresan Yöntemi (IF)
Immünofloresan (IF) yöntemi, immünohistokimyasal boyama deneylerinde bağlı antikorların yerini görselleştirmek için floroforların kullanılmasına dayanan ve aktif olarak kullanılan mikroskobi yöntemidir. İlgili proteinlerin hem yerinin tespitini hem de endojen ekspresyon seviyelerini değerlendirmek için kullanılmaktadır. Hücre kültürü numunelerinde ve doku kesitlerinden elde edilen numunelerin protein, glikoprotein ve diğer antijen içeriklerinin görselleştirilmesinde etkili olarak kullanılmaktadır.
IF yönteminin prensibi oldukça basittir. Fiksasyona (tespit etmek/sabitlemek) tabi tutulan numunenizi hedeflediğiniz proteine yönelik üretilen primer antikor ve sekonder antikor ile inkübe ettikten sonra immünofloresan mikroskopi kullanarak antikoru saptayabilirsiniz. Numunelerinizi mikroskobik görüntüleme için hazırlarken bir lamı üzerine kapatarak mikroskobun yaydığı özel lazerler aracılığı ile yeşil/kırmızı/mavi filtrelerle ile görüntüleyebilirsiniz.
IF yöntemi doğrudan (Birincil) IF veya dolaylı (İkincil) IF olmak üzere 2 şekilde yapılabilmektedir.
1.Doğrudan yöntemde, florofor etiketi doğrudan hedef epitop ile reaksiyona girecek olan birincil antikora konjuge edilmiştir ve tek antikor işaretlemesi ile sonuç alınabilmektedir.
2.Dolaylı yöntemde, iki farklı antikor inkübasyon aşaması vardır. İlk olarak birincil antikor ile işaretleme yapılır ve birincil antikor hedef epitopa bağlanır, sonrasında florofor etiketli bir ikincil antikor ile işaretleme yapılır ve ikincil antikor birincil antikoru tanıyarak ona bağlanır.
Bu iki yöntem arasında doğrudan yöntem daha hızlı iken dolaylı yöntem daha hassas çalışır ve aynı numunede birkaç hedefi tespit etme yeteneğine sahiptir. Bu nedenle dolaylı yöntem daha çok tercih edilmektedir.
IF yöntemine önemli olan adımlar:
Fiksasyon; IF boyama çalışması için alınan numunelerde otolizi önlemek, çürümeyi azaltmak ve antijeniteyi korurken morfolojiyi korumak için önemli bir ön adımdır. Antikorun hedeflenen proteine ulaşmasını sağlamak için numunenin hücresel yapısının bozmadan hedef antijenleri dondurmak ya da hareketsiz hale getirmek amaçlanmaktadır.
Kullanılan fiksatifler her antijen için özgü olmadığından her antijen ve numune için uygun fiksasyon yöntemi seçilmelidir. Kullanılan kimyasal fiksatifler; ayrı ayrı kullanılan veya birlikte kullanılan çapraz bağlanma reaktifleri ve organik çözücüleri içerirler. Çapraz bağlanma reaktifleri hücre içerisindeki bileşenlere ve doku bileşenlerine bağlanarak molekül içi ve moleküller arası çapraz metilen bağları kurarlar. En çok tercih edilen kimyasal fiksatifler formaldehit ve glutaraldehittir. Organik çözücüler ile yapılan fiksasyonlarda amaç hücrelerde lipitleri uzaklaştırmak, hücreleri kurutmak, hücresel bileşenleri denatüre etmektir. Organik fiksatifler hücre zarını geçirgenleştirdiğinden dolayı ekstra deterjan kullanımına ihtiyacı ortadan kaldırmaktadır. En çok kullanılan organik fiksatifler aseton ve methanoldür.
IF yönteminde görüntülemede kullanılan mikroskopların en basit epifloresan mikroskoptur, yaygın olarak kullanılan ise Konfokal mikroskoptur. STED (Stimulated Emission Depletion) mikroskop gibi yüksek çözünürlüklü mikroskopların yeni tasarımları nanoskopiye izin verir ve çok daha yüksek çözünürlük sağlarken daha iyi görsel sonuçlar alınabilmektedir.
Antikorların seçimi; ikincil antikorun doku numunesindeki endojen immünoglobülinler ile çapraz reaksiyonunu engellemek için birincil antikorun konakçı türüne karşı olması gerekir. Genel olarak, ikincil antikorlar, ışıkla uyarılma üzerine yayılan flüoresan etiketlerle konjuge edilir. Florokrom etiketleme floresan antijen tekniği adı verilen bir işlem de kullanılabilir. Bu süreçte bir antijen bir flüoresan prob ile antikora konjuge edilir. Sitoplazmadaki sabit antijen ve canlı hücrelerdeki hücre yüzeyi antijenleri, "membran immünofloresan" olarak bilinen bu tür prosedürlerle boyanabilir. Antikor-antijen kompleksinin tamamlayıcısı da bir flüoresan prob ile işaretlenebilir.
IF yönteminin her aşamasında doğru seçilen ürünlerle görsel sonuçlar göz alıcı olacaktır.
Yazar: Uzm. Bio. Hasine YEL
