Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
Çoğu kişinin Covid-19'dan sonra öğrendiği ancak bilim dünyasında bilinen ve kullanılan yöntemlerin başımda gelen Polimeraz zincir Reaksiyonu (PCR) DNA içerisinde yer alan belirli bölgelerin enzimatik olarak milyonlarca kopyasının oluşturulmasını sağlayan bir yöntemdir. PCR 1980'li yılların başında Biyokimyacı Kary Mullis tarafından geliştirilmiş bir yöntemdir ve bu yöntem Kary Mullis'e 1993 yılında Nobel Kimya ödülünü kazandırmıştır. Kary Mullis tarafından geliştirilen bu yöntem 1980'li yıllardan sonra aktif olarak bilimsel araştırmalarda kullanılmıştır.
PCR tekniği, vücut sıvıları (kan, dışkı, idrar, tükürük), doku, bitki, bakteri, hücre gibi her türlü örnekten izole edilmiş olan DNA örnekleri ile çalışabilmektedir. Yalnızca birkaç saat içerisinde DNA'nın istediğiniz bölgesinin milyonlarca kopyasını oluşturabilirsiniz.
PCR’ da DNA bölgesini çoğaltmak istediniz zaman birkaç biyolojik bileşene ihtiyaç duyarsınız. Bu bileşenler aşağıdaki gibidir.
Şablon DNA, İlk olarak çoğaltmak istediğiniz DNA'ya yani kısa gen bölgesine ihtiyacınız vardır. Bu gen bölgesi çoğaltmak istediğimiz gen bölgesini içerir ve biz buna şablon DNA deriz.
Primerler, şablon DNA'da ki hedef bölgeyi çoğaltmak için reaksiyonun başlamasını sağlayan kısa ve tek sarmallı olacak şekilde tasarlanmış kısa DNA dizileridir. Hedef bölgenin çoğaltılması için forward (ileri) ve reverse (geri) olacak şekilde iki primer dizayn edilmelidir.
dNTP’ ler, DNA nükleotid bazları olarak bilinen ve DNA’ nın yapı taşları olan Adenin (A), Timin (T), Sitozin (C) ve Guanin (G) nükleotidlerinden oluşan bir karışım halindedir. dNTP’ler DNA zincirinin oluşturulması için gereklidirler.
Taq DNA polimeraz, Thermus aquaticus bakterisinden elde edilen ve PCR’ da kullanılan DNA polimeraz enzimi ısıya dayanıklıdır. Şablon DNA’ ya bağlanan primerlerin DNA uzamasını başlatmasının ardından DNA polimeraz enzimi primerlerin uçlarına nükleotidler eklemeye başlar. Böylece her PCR döngüsünde sıcaklık yükselir ve ve işlem başa döner. Her döngüden sonra kopya sayısı ikiye katlanır. PCR için 25-40 döngü yeterli olmaktadır.
PCR çalışması 3 adımdan oluşmaktadır. PCR tüplerinde birleştirilen PCR bileşenleri, enzimin ihtiyaç duyduğu kofaktörlerle ve DNA'nın sentezlenmesine izin veren tekrarlanan döngülerde ısıtma ve soğutma işlemlerine tabi tutulur.
PCR döngüsünün basamakları bu şekildedir;
1- DNA Denatürasyon basamağı, 90-96°C sıcaklığa tabi tutulan çift zincirli DNA’nın çift zinciri arasındaki bağları ayırmak ve tek zincirli DNA’ların elde edilmesi için gerekli bir adımdır.
2-Primer Annealing (bağlanma) basamağında tek zincirli olan DNA’ların sıcaklığın 50-60°C’ ye kadar düşürülmesi ile primerler tek zincirli DNA’lara bağlanarak döngüyü başlatırlar.
3-Primer Extension (uzama) basamağında ise sıcaklık bu basamakta artık 72°C’ye yükseltilir. Taq DNA polimeraz primerleri uzatarak yeni DNA zincirlerinin oluşmasına olanak sağlar.
Bu basamaklar 25-35 döngü tekrar edilmektedir. Hedef bölgelerin uzunluğu PCR cihazının çalışma süresini etkilemektedir. Döngülerin sonucunda reaksiyon verimliliği iyiyse eğer bir ya da birkaç kopyadan oluşan hedef DNA bölgesinin artık milyonlarca kopyası bulunur.
Yazar: Uzm. Bio. Hasine YEL
