Gram Boyama Yöntemi

Gram Boyama Yöntemi

Gram boyama metodunu Danimarkalı bilim insanı Hans Christian Gram bulmuştur. Bu metodu, 1884 yılında, pnömokoklar (Streptococcus pneumoniae) ile Klebsiella pneumoniae bakterilerini ayırt edebilmek için geliştirmiştir. Gram boyama, özellikle mikrobiyoloji alanında, bilinmeyen bakteri türlerinin test etmede kullanılan yöntemin adıdır. Bakteriyel organizmanın tanımlanmasında her zaman ön adım olmaktadır. Bu metot aynı zamanda diferansiyel bir boyama prosedürü olarak da bilinir. Gram boyama, bakterileri hücre duvarlarının kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre iki büyük gruba (Gram-pozitif, Gram-negatif) ayırmak için kullanılan empirik bir yöntemdir. Bazı mikroorganizmaların renksiz olma özelliklerinden dolayı ışık mikroskobu altında gözlemlenemezler bu nedenle bazı renk değişimleriyle daha kolay gözlenmelerini sağlamak için kullanılan bir metottur. Gram boyama, enfeksiyon şüphesi olan vücut sıvılarına ve biyopsi örneklerine de uygulanır. Menenjit şüphesi olan Beyin omurilik sıvısı örneklerinde veya Septik artrit şüphesi olan eklem sıvısı örneklerinde uygulanabilen bu teknik, zamanın kısıtlı ve tedavinin acil olabileceği durumlarda, bazen günlerce beklemeye sebep olan kültür uygulamalarından çok daha çabuk sonuç verir.

 

Gram Boyama Yapılışı

1-Preparat hazırlanır.

a-Lam üzerine 1 damla saf su damlatılır.

b-Mikroorganizma öze ucu ile lam üzerine alınır ve homojen olacak şekilde yayılır.

c-Bek alev ile kurutulur.

2-Preparat kristal viyole solüsyonu ile yıkanır ve 1 dakika beklenir ardından distile su ile yıkanır.

3-Preparat lugol ile yıkanır ve 1 dakika beklenir ardından distile su ile yıkanır (renksiz akana dek).

3-Alkolle 15 saniye yıkanır (Bu aşamada hızlı olmak gerekir).

4-Safranin veya sulu fuksin ile 30 saniye boyanır.

5-Bol su ile yıkanarak boya giderilir.

6-Preparat kurumaya bırakılır.

7-100X objektifte incelemek için immersiyon yağı damlatılır.

8-Bu yöntemde mor renkli görülen mikroorganizmalar gram(+), pembe-kırmızı görülenlerde gram   negatif(-) olarak değerlendirilirler.

 

Gram Boyama Yönteminin Bakterilere Etki Mekanizması

Gram Boyama yöntemi bazı bakterilerin hücre duvarlarındaki peptidoglikan arasındaki reaksiyona dayanmaktadır. Gram boyama, bakterilerin boyanmasını, rengin bir mor renk tonuna sabitlenmesini, hücrelerin renginin giderilmesini ve bir karşı lekenin uygulanmasını içerir.

Birincil leke ( kristal menekşe ) peptidoglikana bağlanarak hücreleri mor renge boyar. Hem gram pozitif hem de gram negatif hücrelerin hücre duvarlarında peptidoglikan bulunur, bu nedenle başlangıçta tüm bakteriler menekşe rengine boyanır.

Gram iyot ( iyot ve potasyum iyodür) mordan veya fiksatif olarak uygulanır. Gram pozitif hücreler bir kristal mor-iyot kompleksi oluşturur.

Hücrelerin rengini açmak için alkol veya aseton kullanılır. Gram-negatif bakterilerin hücre duvarlarında çok daha az peptidoglikan vardır, bu nedenle bu adım onları esasen renksiz kılarken, daha fazla peptidoglikana (hücre duvarının %60-90'ı) sahip olan gram-pozitif hücrelerden rengin yalnızca bir kısmı çıkarılır. Gram pozitif hücrelerin kalın hücre duvarı, renk giderme adımıyla kurutulur, bu da onların küçülmesine ve leke-iyot kompleksini içeride tutmasına neden olur.

Renk giderme adımından sonra, bakterileri pembeye boyamak için bir karşı boya (genellikle safranin, ancak bazen fuksin) uygulanır. Hem gram pozitif hem de gram negatif bakteriler pembe lekeyi alır, ancak gram pozitif bakterilerin koyu moru üzerinde görünmez.

Boyama işlemi doğru yapılırsa gram pozitif bakteriler mor, gram negatif bakteriler pembe olur.

 

Yazar: Moleküler Bio. Rümeysa GÖK