Protein Tayini(Bradford Yöntemi)
Protein Tayini(Bradford Yöntemi)
Bradford (Coomassie Brilliant Blue) Yöntemi
1976 yılında Bradford isimli araştırıcı tarafından geliştirilmiştir. Reaktif olarak genellikle Coommassie Brillant Blue boyası kullanılır. Yöntemin esası boyanın proteinlere bağlanarak renk oluşturması esasına dayanır. Rengin şiddeti protein yoğunluğu ile doğru orantılıdır. Bu boya arginin gibi bazik ve aromatik aminoasitlere bağlanmaktadır. Bu nedenle bu aminoasitlerce zengin proteinlerle etkileşim daha fazladır. Bu yöntemde örnek miktarı ile kullanılan boyanın hacmi ayarlanarak çok hassas ölçümler yapılabilmektedir. Genel olarak küvetli spektrometrik ölçümlerde örnek boya oranı 1:49’dur. Yöntem oldukça kolay ve hassas bir yöntemdir. 595nm’de maksimum absorbans verir. Duyarlılık 150-750μg arasındadır ve ayrıca değişik tekniklerle hassaslık arttırılabilir. Bu nedenler oldukça yaygın kullanılmaktadır. Bazı maddelerle ve özelliklede deterjanlarla (Np40, Triton X….) etkileşimi fazladır. Bu nedenle kullanılmadan önce proteinlerin çözündüğü tamponlardaki (Lizis tamponu, rehidratasyon tamponu…) maddeler bilinmeli ve etkileşim gösterdiği maddeler araştılmalıdır. Örneklerin seyreltilmesi bu etkileşimi giderebilir. Genellikle 10 kat ve üzeri seyreltmeler etkileşimi ortadan kaldırmaktadır.
Protein Tayini Neden yapılır?
1-Gıda maddesinin mevcut kalite standartlarına uygunlunun belirlenmesi acıyla: Örneğin; bir çok standartta her bir gıda maddesi için protein oranı, şu standartdan aşağı olamaz gibi kriterler konulmuştur.
2-Gıda maddesinin besleme değerini belirlemek amacıyla: Gıdaların besleme içeriği toplam ham protein miktarının haricinde diğer bazı kalite indeksleri ile de belirlenmektedir, örneğin; PER (Protein EffIciency Ratio), BV (Biological Value), U (Net Protein Utilization) ve EAO (Esansiyel Amino asit Oranı) vb.
3-Proteinlerin bazı fonksiyonel özelliklerini belirlemek amacıyla: Örneğin; emülsiyon stabilitesi, emülsiyon kapasitesi, su ve yağ bağlama kapasitesi, köpük oluşturma, jel kuvveti, çözünürlük vb kalite özellikleri ile de proteinler hakkında bilgi edinilir.
4-Proteinlerin bazı teknolojik özelliklerinin belirlenmesi amacıyla: Örneğin; canda sayılan fonksiyonel özeliklerin gıda işleme açısından uygunluğu,
5-Bir gıda maddesinin genel bileşiminin tespit edilmesi amacıyla,
6-Satışa sunulacak gıda maddesinin fiyatını ayarlamak amacıyla: Genel olarak bir gıdanın proteini ne kadar çoksa, o gıda maddesi de o kadar değerlidir,
7-Herhangi bir işleme tekniğinin proteinler üzerindeki etkisini belirtileri amacıyla: Örneğin; sterilizasyon, pastörizasyon, fermantasyon vb. işlemlerin gıdadaki proteinlere etkisini belirlemek gibi.
8-Gıda içerisindeki protein çeşitleri veya bunların yapısal özellikleri belirlenmesi amacıyla yapılmaktadır.
Protein tayininde kullanılan yöntemler:
Protein miktarının belirlenmesinde kullanılan bazı yöntemler aşağıda sıralanmıştır.
1- Warburg-Christian yöntemi
2-Biuret yöntemi
3-Lowry yöntemi
4-Bikinkoninik (BCA) asit yöntemi
5-Boya-bağlama(Bradford) yöntemi
Bradford Yönteminin Yapılışı:
1-Bradford belirteci1(ayıraç, reagent) 1:4 oranında seyreltilir (1 ayıracı, 4 Nuclease free water2 ).
2-Daha sonra Whatman-1 filtre kâğıdı ya da benzeri bir kağıt ile filtre edilir ve partikullerden arındırılır.
3-Bu seyreltilmiş ayıraç oda sıcaklığında yaklaşık 2 hafta durabilir.
4-BSA’dan 250, 500, 750 ve 1000μg/ml’lik standartlar hazırlanır. BSA’nin lineer çalışma aralığı 0.2 ile 0.9 mg/ml’dir.
5-100μl örnek ve standart steril ependorf tüpe3 (kör için Nuclease free water ya da proteinin çözüldüğü tampon) steril bir pipet ucu4 ile pipetlenir daha sonra 4,9 ml seyreltilmiş ayıraç üzerine eklenir ve vortekslenir.
6-En az 5 dakika oda sıcaklığında beklenmelidir. Bekleme arttıkça absorbans artar ancak bekleme süresi 1 saati geçmemelidir.
7-Spektrofotometre cihazında 595 nm’de küvetlerle spektrometrik ölçüm yapılır.
Yazar: Moleküler Bio. Rümeysa GÖK
Bradford Yönteminde kullanılabilecek ürünlerin linkleri:
1-https://www.hydrabiotechnology.com/tr/urunler/western-blot-analizleri/bradford-reaktifi/68
2-https://www.hydrabiotechnology.com/tr/urunler/diger-urunler/hydra-nuclease-free-ultra-saf-su/92
4-https://www.hydrabiotechnology.com/tr/urunler/plastik-sarf-malzeme/8?search-text=pipet+ucu
