Gerçek Zamanlı PCR (Real Time PCR (RT-PCR / qPCR))

Gerçek zamanlı PCR klinik laboratuvarlarında ve araştırma laboratuvarlarında aktif olarak kullanılan ve geleneksel PCR yönteminden hızlı ve daha kısa sürede sonuç veren bir yöntemdir. Geleneksel PCR’ın icadı 1984 yılında Kary Mullis tarafından geliştirilmiş ve o yıllarda bilimde devrim niteliğinde kabul görmüştü. Ancak 21. yy. da geliştirilen gerçek zamanlı PCR (RT-PCR) hazırlanan PCR ürünlerinin reaksiyonu sırasında yani eş zamanlı olarak gen ekspresyonlarının tespitine olanak sağlamaktadır. 1990’lü yıllarda geliştirilerek kullanımına başlanan RT-PCR son yıllarda daha aktif olarak kullanılmaktadır.

 

RT-PCR, geleneksel PCR yönteminden biraz daha farklı bir yöntem ile çalışmaktadır. Genel çalışma basamakları benzer olsa da RT-PCR çalışması yapılırken geleneksel PCR da yapılan agaroz jele yükleme basamağı bulunmamaktadır. Çünkü RT-PCR sonuçları geliştirilen yazılım sistemi ile PCR yapılırken eş zamanlı olarak ekspresyon sonuçlarını görüntüleme şansı vermektedir. RT-PCR çalışmaları floresans ışıma prensibi ile çalışmaktadır. PCR döngüsü sırasında meydana gelen amplifikasyonun yaydığı ışımanın bir kamera veya dedektör ile algılanması, cihazdaki yazılım programı ile ışımaların bilgisayar ekranına pik olarak yansıması temeline dayanan bir çalışma prensibi vardır.

 

RT-PCR çalışmalarında floresan etiketli dNTP'ler ya da floresan etiketli problar kullanılmaktadır. Kullanılan floresan problar ya da floresan etiketli dNTP'ler pcr ürünü içerisinde yer alan hedef şablona her bağlandığında cihazda yer alan dedektörün algılayacağı bir florokrom salar. Dedektör bu yayılan florokromu pozitif şablon amplifikasyonu olarak algılar ve bu sinyali yakalar.

 

Kullanılan floresan boyalar temelde 2 sınıfa ayrılır;

1- DNA bağlayıcı boyalar	SYBR Green I, EtBr, Eva green, Cyto 9 gibi boyalar
2- Sekansa özgü problar (Hidroliz probları)	Moleküler işaretçiler, TaqMan, hibridizasyon, Eclipse probları ve Amplifluor, Scorpions, LUX, BD QZyme gibi diziye özgü problar

 

1- DNA bağlayıcı boyalar yöntemi RT-PCR kullanımına yeni başlayanların temelde kullanması önerilen yöntemdir. Kullanılan boyalarda floresan mevcut olduğundan RT-PCR döngüsünde DNA’ya bağlandığında sekans özgü primerler gibi ışıma verecektir. Algılanan ışıma var olan sinyalden 100-1000 kata daha güçlü olmaktadır. DNA bağlayıcı boyalar ile yapılan çalışmalar daha basit, uygun fiyatlı ve güvenilirdir.

 

2- Sekansa özgü probları (Hidroliz probları)yönteminde RT-PCR da kullanılan problar PCR ürününde ki DNA’nın tamamına değil de hedeflenen bölgeye bağlanarak ışıma yapmaktadır. Probların kullanılmasında amaç seçilen bölge içerisinde ki tamamlayacı dizinin varlığını belirlemektir.

 

TaqMan probları çift etiketli olan 5’ ekzonükleaz aktivitesine sahip olan probtur. TaqMan problarının 5’ ucuna bir raportör boya bağlı iken 3’ ucuna ise baskılayıcı boya eklenmiştir. RT-PCR döngüsünde çoğalma işlemi gerçekleşirken TaqMan’ın bağlı olduğu şablon çoğalmaktadır. Döngüde üretilen ürün miktarı arttıkça floresan miktarıda artış gösterecektir.

 

Moleküler işaretçiler TaqMan problarından esinlenerek tasarlanmıştır ve yapısal olarak bir ucunda raportör boya diğer ucunda ise söndürücü boya olan saç tokası benzeri bir yapıdadır. Raportör ve baskılayıcı molekülün komşuluğunda birbirini tamamlayan diziler mevcuttur. Moleküler işaretleyicilerin bağlanması ve ışıma vermesi için DNA’nın tamamen açılması gerekmektedir. İki florokrom birbirinden uzaklaşınca baskılayıcı etki ortadan kalkacağı için ışıma meydana gelir.

 

 

Freet (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 5’ ucunda alıcı boya ve 3’ ucunda floresan boya işaretli olan problardır. Bağlanma sonrasında sentez olmaması için 5’ ucuna fosfat bağlanmıştır. Freet probları spesifik bölgede 1-5 nükleotid yakın bölgelerden bağlanmaktadırlar. Boyaların yan yana gelmesi ile ortaya çıkan enerji ile floresan ışıma oluşmaktadır.

 

Scorpion probları (Akrep probları) iki farklı prob ve primer yerine firkete halkanın doğrudan primerin 5' ucuna dahil edildiği bir tür moleküler işaretleyicidir. 3' ucu, hedef DNA'mızın tamamlayıcı dizisini içerir. Moleküler işaretlerden bile daha spesifiktir.

 

Prob tabanlı yöntemler çoklu şablon DNA dizileri için çoklu probları kullanabilmemize olanak sağlar. Bu, birden fazla şablonu tek bir reaksiyonda verimli bir şekilde çoğaltabilmek için çok büyük avantajdır.

 

RT-PCR, geleneksel PCR' ye benzer şekilde gerçek zamanlı PCR reaksiyonu, floresan boya veya floresan etiketli prob dışında neredeyse aynı bileşenleri içermektedir.

 

Şablon DNA, İlk olarak çoğaltmak istediğiniz DNA'ya yani kısa gen bölgesine ihtiyacınız vardır. Bu gen bölgesi çoğaltmak istediğimiz gen bölgesini içerir ve biz buna şablon DNA deriz.

 

Primerler, şablon DNA'da ki hedef bölgeyi çoğaltmak için reaksiyonun başlamasını sağlayan kısa ve tek sarmallı olacak şekilde tasarlanmış kısa DNA dizileridir. Hedef bölgenin çoğaltılması için forward (ileri) ve reverse (geri) olacak şekilde iki primer dizayn edilmelidir.

 

dNTP’ ler, DNA nükleotid bazları olarak bilinen ve DNA’ nın yapı taşları olan Adenin (A), Timin (T), Sitozin (C) ve Guanin (G) nükleotidlerinden oluşan bir karışım halindedir. dNTP’ler DNA zincirinin oluşturulması için gereklidirler.

 

Taq DNA polimeraz, Thermus aquaticus bakterisinden elde edilen ve RT-PCR’ da kullanılan DNA polimeraz enzimi ısıya dayanıklıdır. Şablon DNA’ ya bağlanan primerlerin DNA uzamasını başlatmasının ardından DNA polimeraz enzimi primerlerin uçlarına nükleotidler eklemeye başlar. Böylece her PCR döngüsünde sıcaklık yükselir ve ve işlem başa döner. Her döngüden sonra kopya sayısı ikiye katlanır. PCR için 25-40 döngü yeterli olmaktadır.

 

MgCl2, Magnezyum gerçek zamanlı RT-PCR sırasında amplifikasyonda çok önemli bir rol oynar. Taq DNA polimerazın aktivitesini iyileştirmek veya artırmak için kullanılır. Primerlerin doğru bağlanmasını kolaylaştırırken DNA erime sıcaklığını arttırır. Aynı zamanda reaksiyon amplifikasyonunu arrtırır. 

 

RT-PCR döngüsünün basamakları bu şekildedir;

 

1- DNA Denatürasyon basamağı, 90-96°C sıcaklığa tabi tutulan çift zincirli DNA’nın çift zinciri arasındaki bağları ayırmak ve tek zincirli DNA’ların elde edilmesi için gerekli bir adımdır.

 

2- Primer Annealing (bağlanma) basamağında tek zincirli olan DNA’ların sıcaklığın 50-60°C’ ye kadar düşürülmesi ile primerler tek zincirli DNA’lara bağlanarak döngüyü başlatırlar.

 

3- Primer Extension (uzama) basamağında ise sıcaklık bu basamakta artık 72°C’ye yükseltilir. Taq DNA polimeraz primerleri uzatarak yeni DNA zincirlerinin oluşmasına olanak sağlar.

 

Bu basamaklar 25-35 döngü tekrar edilmektedir. Hedef bölgelerin uzunluğu RT-PCR cihazının çalışma süresini etkilemektedir. Döngülerin sonucunda reaksiyon verimliliği iyiyse eğer bir ya da birkaç kopyadan oluşan hedef DNA bölgesinin artık milyonlarca kopyası bulunur.

 

RT-PCR’ın PCR’a göre avantajları nelerdir?

 

Yöntem PCR çalışmasına göre daha uygun maliyetlidir. Zaman açısından daha verimlidir, DNA’ların yürütülmesi için agaroz jel elektroforezi süresinden kazanç sağlar. Daha özgül ve spesifik olduğundan tercih sebebidir. Çok az şablon DNA ile sonuç alabilirsiniz. Sonuç olarak erime eğrisi çizimine olanak sağlar.

 

RT-PCR kullanım alanları nelerdir?

 

Gen ekspresyon analizinde, Kanser araştırmalarında, İlaç araştırmalarında, Hastalık teşhisinde, Virüslerin miktar tayininde, Gıda testlerinde, GDO yüzdelerinin saptanmasında, mikroRNA analizlerinde, Mikrbiyal yük testlerinde, Patojen genotiplenmesinde, Patojenik SNP tespitinde RT-PCR analizleri kullanılmaktadır.

 

RT-PCR sonuç görseli tanımlama:

Bir RT-PCR çalışmasının sonucunda aşağıdaki gibi bir görsel elde edilmektedir. Bu görselin her bir kısmı bize PCR döngüsü hakkında bilgi vermektedir. Anlık olarak döngüleri takip ederek pik oluşumunu izleyebilmek RT-PCR’ın geleneksel PCR’dan ayrılmasını sağlamaktadır. Döngüler sonucunda oluşan nükleik asit miktarı tespit etmek için jele ihtiyaç duyulmadığı için daha pratik ve kolaydır. Aşağıdaki görseli inceleyerek PCR döngüsünün bize neler anlattığını anlayabilirsiniz.

 

Exponential Faz:  PCR ürünün miktarı her döngüde tam olarak iki kat artmaktadır. Reaksiyon spesifik ve reaksiyon etkinliği %100 olmaktadır.

 

Linear Faz (yüksek farklılık): Reaksiyonun kompanenetleri tükenmeye başlamaktadır. Reaksiyon yavaşlamaya başlarken oluşan PCR ürünleri bu fazda degrede olmaya başlamaktadır.

 

Plateu Faz (Endpoint): Reaksiyon bu faz itibariyle artık sonlanmaktadır. PCR ürünlerinin degrede olması hızı bu fazda artmaktadır.

 

Thereshold çizgisi ve CTdeğeri:  Ct değeri, numunen içerisinde ki nükleik asit miktarı ile ters ilişkilidir. Düşük Ct değeri hedeflenen nükleik asidin yüksek miktarda olduğunu gösterirken, yüksek Ct değeri ise hedef nükleik asidin daha düşük (ve bazen çok az) miktarlarda olduğunu ifade eder.

 

CT değerinin 29. döngüden az olması yüksek miktarda nükleik asit varlığını gösterirken CT değeri 38. döngünün üzerinde olduğunda düşük miktarda nükleik asit varlığını göstermektedir.

 

RT-PCR / qPCR da kullanabileceğiniz ürünleri https://www.hydrabiotechnology.com/tr/urunler/qpcr-reaktifleri/4 adresinden inceleyebilirsiniz.

 

Yazar: Uzm. Bio. Hasine YEL